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2022-11-303695 次瀏覽
核酸提取

核酸提取是指將核酸(DNA和RNA)從細(xì)胞中提取出來的過程,總的來說包括細(xì)胞裂解、核酸純化及后續(xù)核酸濃度、純度測定的步驟。根據(jù)原始樣品的種類和核酸產(chǎn)物后續(xù)的各種應(yīng)用目的,細(xì)胞裂解和核酸純化步驟有不同的處理方法和要求。


一、實驗室中的DNA提取:

案例一:小鼠基因型判定實驗的模板DNA提取

初始樣品為小鼠尾切段。基因型判定實驗對DNA模板的濃度、純度要求不高,消化提取過程相對簡單。


實驗步驟:

1.將1cm尾巴切段置于1.5mL微量離心管中,加入適量裂解液(Lysis buffer)和蛋白酶(Proteinase K)于55~65℃水浴過夜消化。

2.充分消化后的尾巴樣品加入沉淀液(Precipitation buffer)后用旋渦混勻器來使雜質(zhì)蛋白充分沉淀,雜質(zhì)沉淀后通過離心操作(如4℃,4000Xg,5min),取出溶有目標(biāo)DNA的上清液,丟棄雜質(zhì)沉淀。

3.上清液中加入100%異丙醇,小心顛倒離心管30~40次,便可以將產(chǎn)物DNA沉降。離心操作(4℃,10000Xg或12000rpm,10min)去除上清。

4.用75%乙醇洗滌兩次DNA產(chǎn)物,待乙醇充分揮發(fā)后,用水或TE緩沖液(Tris-EDTA buffer)收獲DNA模板產(chǎn)物。


進行后續(xù)的PCR擴增實驗前,可以使用Nanodrop儀器來進行DNA濃度和純度的測定來提高PCR反應(yīng)的成功率。在PCR擴增實驗不順利的情況下,也可以進一步對DNA產(chǎn)品的完整度進行檢測,具體方法可以參考核酸檢測和核酸擴增的有關(guān)內(nèi)容。


案例二:用于重組的質(zhì)粒DNA提取

用于重組的質(zhì)粒對DNA產(chǎn)物的濃度、純度和完整度都要求較高,否則無法成功完成質(zhì)粒酶切和酶連的步驟。


實驗步驟:

1.從含有過夜培養(yǎng)大腸桿菌的試管中取出適量菌液置于微量離心管中,低速離心(4000Xg, 5min)處理后收獲大腸桿菌,除去培養(yǎng)液。

2.使用質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid DNA extraction kit)提取大腸桿菌質(zhì)粒。原理菌體裂解后,加入中和液(Neutralization buffer)過微型柱,使DNA特異結(jié)合于柱上,而其他雜質(zhì)會過柱洗脫。最后用洗脫液(Elute buffer)洗下DNA即可得到質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。

3.經(jīng)試劑盒提取后的質(zhì)粒DNA有時需要經(jīng)電泳切膠回收的操作將目標(biāo)質(zhì)粒DNA與其他DNA分離。切下的膠消化后經(jīng)DNA純化試劑盒純化即可得到純度較高的目標(biāo)質(zhì)粒DNA。具體的內(nèi)容可以參考核酸檢測的有關(guān)內(nèi)容。


二、實驗室中的RNA提取

[ RNA Extraction: Principle, Procedure, Protocol and Importance  – Genetic Education]:

RNA提取過程與DNA類似,也是通過裂解細(xì)胞后通過有機溶劑(苯酚、氯仿、異戊醇)沉降雜質(zhì)的方法來分離RNA。但RNA的穩(wěn)定性比DNA低很多,因此對RNA提取對溫度和污染清除的要求更高。實研操作一般從以下幾個角度來提升成功率:降低RNA水解酶活性、提升RNA穩(wěn)定性、使RNA與DNA和蛋白分離、僅沉降RNA、有效去除DNA。


案例一:總RNA提取

實驗步驟與DNA提取類似,但有機溶劑的使用會有所不同。在首次離心后,混合物會分為三層,RNA溶于上層無色水相,而DNA和蛋白會處于中間層,組織殘渣等雜質(zhì)處于底層酚-氯仿相中2。

實驗步驟:

1.向提取樣品中加入裂解液(如Trizol),裂解細(xì)胞與組織,室溫靜置5-8分鐘。

2.加入氯仿,充分混勻后離心(4℃,12000rpm,10min),取出上清液。

3.向上清液中加入異丙醇沉降RNA,并離心(4℃,12000rpm,10min)棄去上清。

4.用75%乙醇洗滌產(chǎn)物兩次,待乙醇揮發(fā)后加入RNase-free水溶解產(chǎn)物。


實驗中用到的耐思耗材和儀器:

槍頭、微量離心管、(15、50mL)離心管、迷你旋渦分離器(105003)。

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