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2022-11-303639 次瀏覽
核酸檢測

一、實驗室常用核酸的濃度與純度檢測

核酸濃度與純度檢測最簡單常用的儀器是微量紫外分光光度計,代表為NanoDrop。NanoDrop分光光度計利用分子的紫外吸收特性來測定樣品濃度。核酸吸收峰為260nm,蛋白樣品吸收峰為280nm。此外,很多提取過程中殘留的污染物通常在280nm和230nm處有吸收峰。[ NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN]樣品濃度與吸光度成正比關系(Beer-Lambert Law),因此通過測定吸收峰就可以得出核酸樣品的濃度。

核酸樣品的純度可以由A260/A280、A260/A230兩個比值來反應。純度較高DNA的A260/A280應在1.8左右,RNA在2.0左右。若DNA樣品的A260/A280數(shù)值偏向2.0,則表明存在RNA污染,如有需要應使用RNA酶處理樣品并純化,反之亦然。A260/A230數(shù)值可以反應樣品中有機物污染水平,一般大于2.0則較好,若偏低則表示產(chǎn)物中含胍或乙醇等有機物的污染(如表1所示)。


比值 測定樣品 “純”樣品的比值范圍 比值異常的原因
A260/A280 核酸 DNA: ~1.8 RNA: ~2.0 造成低比值的污染物: -蛋白質(zhì) -核酸提取步驟中的殘余苯酚和其他試劑
A260/A230 核酸 DNA/RNA: ~2.0-2.2  

造成低比值的污染物: -蛋白質(zhì) -碳水化合物 -提取中的殘余苯酚 -殘余胍(常見于提取柱類方法) -用作輔助沉淀劑的糖原 造成高比值的原因: -空白對照有誤
A260/A280 蛋白 ~0.6 造成高比值的污染物: -核酸

表一 紫外吸收法反應純度的關鍵比值2

DNA的濃度檢測經(jīng)常會影響后續(xù)實驗的操作,濃度過高和過低都會影響PCR、酶切酶連等反應的進行。因此要進行適當稀釋,保證反應體系中DNA終濃度在合適的范圍內(nèi)。
另外一種常用的核酸檢測方法為熒光光度法(代表常用儀器為Qubit),利用核酸與靶標選擇性染料結(jié)合后發(fā)光的原理來檢測濃度,可以檢測濃度非常低的樣品,靈敏度比紫外分光光計高。該方法檢測不同性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的核酸時需要特定的試劑盒,因此成本較高。

二、實驗室核酸樣品質(zhì)量檢測
核酸電泳是常用于檢測DNA與RNA完整性的方法。將核酸樣品加入瓊脂糖凝膠上的加樣槽后,通過電泳作用,不同大小的核酸分子會以不同速率向正極遷移。長鏈、環(huán)形的核酸遷移速度比短鏈、線型的核酸分子慢。通過熒光染料溴乙錠或商品化染料SybrGreen、GelRed等染料染色,電泳結(jié)束后即可在紫外下觀察核酸分子的遷移情況。與核酸大小標準物對比即可判斷核酸樣品是否存在斷裂或污染的情況。

NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN
NanoDrop Spectrophotometer Resources | Thermo Fisher Scientific - CN

核酸檢測過程中可以用到的耐思耗材:
槍頭(100μL、200μL、1000μL等);微量離心管(1.5mL、2mL);PCR管類。
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