久久婷婷五月综合色欧美_久久精品国产亚洲avapp下载_中文字幕精品一二三四五六七八_国产三级在线观看播放_亚洲香蕉成人av网站在线观看

購物車(
清空購物車
2023-09-0723119 次瀏覽
PCR實驗中應(yīng)該注意的問題有哪些?

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

你在做PCR實驗的時候遇到過哪些問題?來看看前輩們的經(jīng)驗。


查看PCR耗材http://xinruzhou.com/product/detail/513011595283009536

沒有ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計不合理, 需要重新設(shè)計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛0暹M行稀釋。

陰性對照擴增有信號

照擴增有信號排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng),造成交叉污染:

1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2、引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度,并注意上下游引物的濃度配比。

3、鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix試劑盒。

4、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增。

5、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染, 建議對操作環(huán)境進行處理, 或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

標(biāo)準曲線不佳

標(biāo)準曲線線性關(guān)系不佳R2<0.9,很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:

1、標(biāo)準品稀釋或者加樣誤差,使得標(biāo)準品不呈梯度;

2、標(biāo)準品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準品反復(fù)凍融,將高濃度DNA模板分裝,保存于-20℃或-80℃,現(xiàn)配現(xiàn)用;

3、引物或探針不佳。重新設(shè)計更好更穩(wěn)定的引物或探針;

4、模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求,一般模板量以50—500ng為宜。

熔解曲線峰不特異

熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題

1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn); 引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時, 適當(dāng)降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例;

2、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入, 或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增。

3、離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的mix試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合, 有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果;

擴增曲線異常

遇到擴增曲線異常,比如“S”型曲線等等情況,有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:

1、模板的濃度太高或者降解;

2、熒光染料的降解;

3、在操作熒光定量PCR時,帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等;

4、液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā),沒有很好的聚集在管子里;

5、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。

擴增效率低

該情況適用于針對所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴增信號時,應(yīng)考慮如下情況:

1、反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳,另外考慮熒光染料是否降解;

2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化??蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法,適當(dāng)延長變性退火時間;

3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋,再加入反應(yīng)體系,減少抑制物的影響。????

一本大道无码人妻精品专区| 国产另类ts人妖一区二区| 久久国产色av免费看| 48久久国产精品性色aⅴ人妻| 国产成a人亚洲精品无码樱花| 欧美超级乱婬视频播放| 亚洲av无码成人精品国产| 欧美成人秋霞久久aa片| 一区二区三区在线 | 欧洲| 在线视频日本三区精品| 日本免费一本天堂在线| 沈阳熟女露脸对白视频| 亚洲色成人网一二三区| av香港经典三级级 在线 | www国产精品内射老师| 美丽的熟妇中文字幕| 国产精品线在线精品| 久精品国产欧美亚洲色aⅴ大片| 日韩超碰人人爽人人做人人添| 色婷婷亚洲一区二区三区| 欧美超大胆裸体xx视频| 潮喷大喷水系列无码久久精品| 男人女人做爽爽18禁网站| 亚洲一区二区三区香蕉| 午夜寂寞少妇aaa片毛片| 99久久久精品免费观看国产| 国内老熟妇对白hdxxxx| 青草伊人三级在线视频| 亚洲色成人网站www永久四虎| 人妻精品中文久久一区| 国产一区日韩二区欧美三区| 在线а√天堂中文官网| 国产又色又爽又黄又免费| 国产白丝一区二区三区| 亚洲一码二码三码精华液| 久久久精品国产亚洲av日韩| 少妇的丰满人妻hd高清| 99久热只有精品视频| 日韩精品人妻中文字幕有码| 国产良妇出轨视频在线观看| 久久综合狠狠色综合伊人|